| 衣原体感染鉴别与诊断 |
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诊断与鉴别诊断
实验室诊断
沙眼衣原体感染实验室诊断
诊断沙眼衣原体感染常用的实验室方法有以下几种：
①标本涂片染色直接镜检；
属于衣原体细胞学检查法。在感染细胞内可有衣原体的包涵体存在。从感染部位采取细胞标本作涂片，将临床标本涂片后，作姬姆萨染色、碘染色或帕氏染色，镜下观察。姬姆萨染色包涵体是蓝色或暗紫色，碘染色显示褐色。这是一种简便、价廉的诊断方法，可用于新生儿眼结膜刮片的检查，但它不适宜用于泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断，因为在这种情况下，它的敏感性（40%）和特异性均极低。目前已较少采用。
②细胞培养法；
对沙眼衣原体敏感的细胞株为McCoy细胞、Hela-229细胞和BHK细胞，最常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞，孵育后，用单克隆荧光抗体染色，可迅速诊断，但操作人员一定要熟练，需专业培养。阳性即可确立诊断。
此法是目前检测沙眼衣原体感染最为敏感和特异的方法，在有经验的实验室，敏感性为70%～95%。此法可用作证实试验和治疗后的判愈试验。缺点是耗时、费钱，需一定的实验设备，不过大批量标本同时处理可降低成本。
作细胞培养取材很重要。对女性患者，一般取宫颈管标本，方法是先用一根长棉拭擦去宫颈表面粘液，弃去； 再用另一根长棉拭插入宫颈管1～2cm处，捻转数圈，停留10秒后取出送检。作沙眼衣原体检查时，拭子标本放入标本运送液中，负85℃低温冰箱保存待用。对于新生儿眼炎或肺炎，也可取结膜刮片标本及痰液、支气管洗出液等。
③抗原检测试验，包括直接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验；
也属于衣原体细胞学检查法。
直接免疫荧光法
近年来采用荧光素标记的抗衣原体单克隆抗体，来检测细胞涂片中的衣原体，使用较为方便。
针对沙眼衣原体主要外膜蛋白(Syva,Difco,Kallestad 的产品 )或脂多糖(Bartels,Boots Celltech,Califonia Integrated Diagnostic的产品)的单克隆抗体与相应的抗原结合，单克隆抗体标有荧光素，在荧光显微镜下，阳性者可见到亮苹果绿的原体和始体。此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性为70%～90%，特异性为83%～99%。由于有可能将某些发光颗粒(白细胞、上皮细胞、色素颗粒)、细菌和酵母菌误认为沙眼衣原体，因此此法对于实验人员的技术水平要求较高。
直接免疫荧光法的优点是：快速，价廉，操作简便，标本的贮存和运送方便，标本中的沙眼衣原体不必是存活的或是有感染性的。由于已经有商品化的试剂盒供应，因而方便了使用。缺点是在低感染率的人群中敏感性差，受实验人员的主观影响大。它最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群(如性病门诊病人)。
目前主要用衣原体外膜蛋白（MOMP）的单克隆抗体的商品试剂（Mico Trak，Pathfinder，Monofluor）。结果判断：要衣原体数>10个才能判为阳性。
酶联免疫吸附试验
将沙眼衣原体抗体致敏聚苯乙烯小珠 ( Chlamydiazyme，为Abbott的产品)或包被微量板孔(IDEIA,为 Boots Celltech 的产品；Pathfinder，为Kallestad的产品)，捕获标本中的沙眼衣原体抗原，通过酶联显色反应而判断结果。此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性与直接免疫荧光法相当，而特异性稍有不如(90%左右)。试验结果阴性时，不能完全排除沙眼衣原体感染，有可能是沙眼衣原体数量不足或标本采集不当的缘故。
此法的一个显著优点是自动化程度高，可同时检测大批量标本，结果判断客观性强。它与直接免疫荧光法一样，最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群。在低流行率的人群中应用时，解释结果宜慎重。
胶体金免疫扩散试验
在两块长方形塑板中衬有检测滤纸条，滤纸条上吸附有抗沙眼衣原体单克隆抗体。在塑板的“样本窗”加样，通过毛细作用，渗入“结果窗”，如为阳性则见细线形成。此法诊断女性宫颈沙眼衣原体感染的敏感性为87%，特异性为98.8%。此法的优点是简易，方便，快速，尤其适用于基层单位。缺点是标本中需要足够数量的沙眼衣原体抗原。目前厂家仅推荐用于诊断女性生殖道沙眼衣原体感染。
④DNA杂交及聚合酶链反应(PCR)法；
聚合酶链反应
这是一种体外扩增特异DNA片段的方法， 用于诊断沙眼衣原体感染的PCR法已有商品化试剂盒(Amplicor C. trachomatis test)。PCR法诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性高,在细胞培养阴性者亦能检测出沙眼衣原体感染。在一项比较研究中,PCR、培养和Gen-Probe的敏感性分别是95%、86%和65%。有研究发现，PCR的特异性达到99％～100％。一种PCR(以质粒DNA顺序为引物)阳性而培养阴性的标本可以用另一种PCR(以不同的质粒DNA顺序或主要外膜蛋白基因顺序为引物)证实,说明可能并非是PCR假阳性结果。然而,也有报告由于“残留（carry over）”污染而造成PCR假阳性,或因标本中含有Taq酶抑制物质而使PCR假阴性。在PCR反应体系中加入内参照可以发现假阴性问题；此时可将标本以反复冻融几次或冻存较长时间或稀释等方法来解决之。临床上，PCR的结果应该结合病史和治疗情况进行分析,必要时重复取材或在另一部位取材作试验。以沙眼衣原体主要外膜蛋白基因顺序为引物，进行PCR扩增，扩增产物以限制性内切酶酶切，分析酶切产物，即PCR-RFLP，可用于对沙眼衣原体进行分型。此种基因学分型结果与血清学分型结果基本一致。
LCR法也已用来检测沙眼衣原体感染。如,以沙眼衣原体隐蔽性质粒顺序为引物,利用LCR法检测718份尿液标本的沙眼衣原体,并与细胞培养法相比较。两者结果不一致时,再用DFA和另一种LCR(以沙眼衣原体主要外膜蛋白基因顺序为引物)加以验证。这样,观察到LCR的敏感性和特异性分别为94.5%和99.5%;阳性预期值和阴性预期值分别是97.5%和98.8%,而细胞培养的敏感性只有57.1%。LCR与PCR法均能一致扩增沙眼衣原体的DNA数量达3个衣原体原体水平。
沙眼衣原体核酸扩增技术的另一进展是可用清晨首次尿（或禁尿4小时后的首次尿）作为标本。据报告，男性尿液标本以PCR或LCR作沙眼衣原体检测，敏感性为93.5％～100％，特异性为99.1％～100％，而尿道拭子培养的敏感性平均为68.2％。女性尿液标本以LCR检测沙眼衣原体的敏感性为95.7％，特异性为100％，而宫颈管拭子培养的敏感性为59.6％。由于尿液取材方便，对患者无侵害，因此这种方法适合于在不同人群中进行大规模筛查，也适合于边远地区标本采集后运送至中心实验室进行检测。
PCR实验在操作时，尤其要避免外界污染及残留污染，以免发生假阳性。PCR的开展需要一定的实验条件，实验人员需具备较为熟练的分子生物学操作技术。最好在实验条件较为成熟的实验室开展。
[PCR检测衣原体DNA操作技术]
（1）标本的处理：
① 取材部位为子宫颈管，男性为尿道，将灭菌白金耳深入宫颈管或尿道1cm左右，转动数圈，停留约30s，取出后置标本缓冲液中。
②衣原体DNA提取：
将宫颈管内或尿道内刮取物置含0.5% NP-40、0.5% Tween 20，1% SDS和2mg/ml 蛋白酶K的TES缓冲液（50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，100mmol/L EDTA，pH 8.0）置37℃裂解60min，沸水5min，酚、氯仿抽提DNA，乙醇沉淀 ，沉淀物溶于20?lTE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。
（2）引物设计：
引物对选自衣原体16SrRNA基因，为衣原体属特异性，以DNA合成仪固相亚磷酸三酯合成并纯化。引物对的序列分别为5′GTGGATAGTCTCAACCCTAT 3′(16SrRNA基因位点832-851)和5′TATCTGTCCTTGCGGAAAAC3′(位点1041-1022)。目的扩增片段（832-1041）长210bp。
（3）PCR扩增：
传统的方法反应体积为100?l，含5x反应缓冲液20?l和FD-DNA聚合酶2U、4种dNTP各200?mol/L以及引物对各25pmol/L。上述成分预先一次性分装于0.5ml离心管，-20℃备用。临用加模板DNA 2?l，短暂离心，加100?l矿物油覆盖。现在试剂已商品化，反应体积为25?l，单管已分装好，只要加入模板DNA即可。置DNA扩增仪进行40次循环扩增。每次循环包括90℃变性45s(第一次循环变性2min)，55℃退火30s和72℃延伸40s（最后一次循环72℃，延伸5min）三个步骤。每次扩增均应作阴阳性对照。
（4）扩增产物的检测
① 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测：取10u l PCR扩增物作1.5%琼脂糖凝胶电泳、0.5?g/ml溴化乙锭染色，以PGEM-3Zf（+）DNA-Hae Ⅲ为分子量标准，置紫外透射仪观察结果。
② 生物素寡核苷酸探针的检测
a.探针序列及合成：探针序列为5′ACTCAA-AAGAATTGACGGGGGCCCGCACAA 3′(30mer)GOPLA，衣原体16Sr RNA基因中的位点为909-938，与PCR扩增片段中间序列互补。以DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化。
b.标记：按Riely等方法略有修改。以末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）催化Bio-11-dUTP标记到合成的寡核苷酸探针片段3′-OH端。反应体系含：140mmol/L二甲胂酸钠，30mmol/L Tris-HCl（pH 7.6），100?mol/L Bio-11-dUTP，0.1?mol/L 寡核苷酸片段，0.05%BSA，300U/mlTdT。于37℃保温3h后，加10mmol/LEDTA终止。寡核苷酸片段探针标记后，将标记探针（1ng/?l）作2倍系列稀释，取5?l点膜,封闭后显色。结果探针经32倍稀释（最高稀释度5ng）后仍呈现明显的显色反应，证实探针的标记以及显色效应良好。
c.DNA斑点杂交：提取的DNA或其PCR扩增产物0.5mol/L NaOH变性20min，取5?l点于硝酸纤维素膜，烘干；以6×SSC(1xSSC为：0.15mol/L NaCl，0.015mol/L柠檬酸三钠，pH 7.0)浸泡2次，80℃干烤2h。置6×SSC，5×Denhardt液，0.2%SDS，50?g/ml变性牛胸腺DNA，10mmol/L EDTA中于55℃杂交3h后，加入终浓度为150?g/ml的探针，于55℃杂交过夜。以2×SSC-0.1%SDS室温漂洗3次，每次15min。
d.显色：将杂交漂洗后的滤膜浸泡于0.1mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，0.15mo l/L NaCl，0.05%Tween20，0.05%%TritonX-100，2%BSA中，37℃封闭6min；置4?g/ml亲和素的缓冲液A（0.1mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH 7.5）中，37℃孵育30min，缓冲液A漂洗3次；再置于含1?g/ml生物素化碱性磷酸酶的缓冲液A中，37℃作用30min，缓冲液A漂洗2次，缓冲液B（0.1mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，50 mmol /L MgCl2，pH 9.5）漂洗2次。最后将膜泡于含0.1mg/ ml磷酸萘酚AS-MX和0.6mg/ml坚固蓝RR的缓冲液B中，暗处显色30min。
PCR扩增衣原体DNA有十分高的特异性及敏感性，结合生物素标记的衣原体寡核苷酸探针作DNA斑点杂交。可作为衣原体诊断的金标准，其敏感度可以检测相当于1个拷贝的衣原体DNA分子。
⑤血清抗体检测；
尽管沙眼衣原体感染时血清和泌尿生殖道分泌液中会出现抗体，但血清学试验对于诊断无并发症的泌尿生殖道感染价值不大。免疫反应为期短暂，且再感染常有发生。血清抗体在性病高危人群中有较高的本底检出率。不过，在性病性淋巴肉芽肿(LGV)和沙眼衣原体性附睾炎、输卵管炎时血清抗体水平明显升高，检测血清抗体水平有助于诊断。新生儿衣原体肺炎也可用血清学方法测定抗衣原体IgM抗体，具有诊断价值。方法有酶联免疫吸附试验和微量免疫荧光法，后者的操作较繁琐，不过，目前已有简化的L2抗原免疫荧光试验。Orgenics的Immunocomb和Bio Merieux的MicroEIA均是酶联免疫吸附法，所不同的是前者是将抗原包被于塑料梳齿上，后者则是包被于微量板孔中。当抗体滴度达一定水平( 如女性≥1：128，男性≥1：64)时，提示有并发症(附睾炎或输卵管炎)，或为LGV。 由于沙眼衣原体感染后血清阳转需2～3周时间，因此抗沙眼衣原体IgG检测阴性不能完全排除感染。 而病人即便经治疗后，IgG升高仍能持续较长时间，故阳性结果也不一定证明有感染存在。
诊断衣原体性疾患，目前在我国尚未普及，因此，往往漏诊，所以应当重视临床表现，争取做到化验室检测指标求得确诊。
检测出病原体或病原体特异性DNA是诊断本病唯一标准，近年来由于对CT直接分离培养成功，加之基因诊断技术在CT诊断方面的成功应用，使过去认为难以诊断的疾患已提高到最易诊断的一种疾患，但是上述两项技术特殊，对操作人员及实验设备要求严格，在一般医院实行起来尚难完成。一般只用CT抗原法进行诊断。
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